Biotehnologie enzime de inginerie genetică - revers transcriptaza

Enzimele Ingineria genetică

revers transcriptaza

Revers transcriptaza este utilizat pentru transcripția ARNm în catenă de ADN complementar. Cand au studiat retrovirusuri, genomul care conține molecule monocatenare ARN, sa constatat că, în procesul de integrare etapa retrovirus intracelulară trece genomul sale in forma de ADN dublu catenar in cromozomi ai celulei gazdă. In 1964 g. Temin ipoteza existenței virusspetsifichnogo enzimă capabilă de a sintetiza un ARN complementar cu matricea ADN-ului. Eforturile pentru izolarea enzimei nu au avut succes și Temin 1970 g. Mizutani cu și independent de Baltimore deschis preparatul enzimatic dorit virioni extracelulari ale virusului sarcomului Rous. Acest ADN polimerază ARN-dependentă numită revers transcriptazei sau revers transcriptaza.

Studiul cel mai detaliat al păsărilor retrovirale revers transcriptazei. Fiecare virion conține aproximativ 50 de molecule ale acestei enzime. Revers transcriptaza este compusă din două subunități - a (65 kDa) și b (95 kDa) prezente în cantități echimolare. Revers transcriptaza are cel puțin trei activități enzimatice:

1) polimeraza ADN, folosind ca matriță atât ARN și ADN;

2) activitatea RNazei H hidrolizează ARN în compoziție ARN hibrid - ADN-ARN, dar nu simplu sau dublu catenar;

3) o activitate endonucleazică ADN.

Primele două activități sunt necesare pentru sinteza ADN-ului viral si endonucleazică, aparent, este important pentru integrarea ADN-ului viral în genomul celulei gazdă. reverstranscriptaza purificată sintetizeaza ADN-ul ambelor ARN și ADN matrici. Pentru a începe sinteza, revers transcriptaza, precum și alte polimeraze, avea nevoie de o porțiune scurtă dublu catenară (primer). Grundul poate fi segment mono-catenar atât ARN și ADN, care în timpul reacției sunt legați covalent la catena ADN nou produs.

Fig. Schema 35. Sinteza de copii de ADN dublu catenar de molecule de ARN

Reverstranscriptazei este de preferință utilizat pentru transcripția ARN mesager într-un ADN complementar (ADNc). Reacția de transcriere inversă este realizată într-un condiții special alese folosind inhibitori puternici ai activității RNazei. Astfel, este posibil să se obțină în lungime completă copie ADN a moleculelor țintă ARN. Ca amorsa cu transcrierea inversă a poli (A) -conținând ARNm folosind oligo (dT), și pentru o moleculă de ARN lipsit de Z'poli-end (A), - oligonucleotide sintetizate chimic complementare ARN Z'-end studiat. După sinteza ADN-ului cu lanț complementar ARNm și distrugerea ARN (tratament alcalin utilizat de obicei) se efectuează sinteza catenei a doua ADN. Astfel, capacitatea de a folosi revers transcriptaza, pentru a forma o 3'-terminații de ADNc monocatenar a fost autocomplementare ac de păr, care poate îndeplini funcția unui primer.

Șablonul servește ca prima bandă cADN. Această reacție poate fi catalizată de ambele revers transcriptazei și ADN-polimerazei I de E. coli. Este demonstrat că asocierea acestor două enzime crește randamentul de molecule dublu catenare cu drepturi depline ADNc. La finalizarea sintezei primei și a doua bandă cADN rămâne în buclă în ac de păr legat covalent, care a servit ca primer în sinteza catenei a doua. Această buclă este clivat de S1 endonuclease, distrugând în mod specific siturile monocatenare acizilor nucleici. Formată la capetele nu sunt întotdeauna obtuz, și pentru a îmbunătăți eficiența clonarii ulterioare sunt reparate Blunt cu fragmentul Klenow al ADN-polimerazei I de E. coli. CADN-ul dublu catenar rezultat poate încorpora apoi în vectori de donare propagate în molecule ADN hibride și utilizate pentru studii ulterioare.

Alte capitole din această secțiune: