ingineria genetică

Studiul moleculelor de ADN

În ultimii ani, metodele de testare ADN-ului primit de dezvoltare extraordinară. Printre metodele cele mai îmbunătățite prin care ADN-ul studiat includ metode pentru a crea molecule de ADN prin unirea secvențe având destul origini diferite. Produsul rezultat se numește ADN recombinant.

ADN-ul recombinant cuprinde o genă (sau gene) și un vector. Vector - un fragment de ADN care asigură sinteza ADN hibrid de reproducere și activitatea produselor finale ale sistemului genetic - proteine. Principalele studii au fost efectuate pe bacterii și viruși, deoarece acestea sunt printre cele mai simple organisme, altfel denumite celule, „maestrul“. Tehnologia ADN-ului recombinant permite obținerea unor versiuni modificate genetic orientate și mod strict controlat.

Cum, atunci, genele organismelor superioare pot fi introduse în celule bacteriene? Cea mai comună metodă este metoda de ADN recombinant inginerie genetică, t. E. conțin plasmide de gene străine. Plasmidele sunt circulare molecula de ADN dublu catenar constând din câteva kilobaze. Fiecare bacterie, în plus față de principal, nu iese din ADN-ul celulei (5106 perechi de baze) pot conține mai multe plasmide diferite, care comunică cu alte bacterii.

Plasmidele sunt replicate genetice autonome (t. E. Multiplicarea) în celula bacteriană nu este în același timp în care molecula de ADN principal. Deși plasmide conturi pentru doar o mică parte din ADN-ul celulei, acestea sunt astfel de gene vitale pentru bacterii ca gene de rezistență la medicament. Diferite plasmide conțin gene diferite de rezistență la antibiotice. Dispozitiv de plasmide ușor și ușurința cu care acestea sunt „incluse“ și „ieșire“ din bacteriile care folosesc inginerii genetice pentru introducerea genelor în celulele bacteriene ale organismelor superioare.

Un instrument puternic pentru ingineria genetică sunt deschise în 1974, enzime - endonuclează de restricție sau o enzimă de restricție.

Restricție înseamnă literal „limitare“. Celulele Bacteriile produc enzima de restricție pentru spargerea unei străine (ADN în principal fagul), este necesară limitarea infecției cu virus. Enzimele de restricție „recunosc“ secvență specifică de nucleotide în ADN-ul (așa-numitele site-uri - site-uri de recunoaștere), și să contribuie pauze simetrice în spiralele ADN la distanțe egale de site-ul central. Ca rezultat, la capetele fiecărui fragment restrâns de ADN monocatenar format scurt „cozi“, care sunt numite „capete adezive“.

De la diferite specii de bacterii are aproximativ cinci sute de endonucleaze de restricție diferite, care sunt descrise situri de restricție.

metode de inginerie genetică

Pentru ADN-ul plasmidic recombinant dintr-o plasmidă este scindat cu enzima de restricție aleasă. Genele care trebuie să intre în celula bacteriană, segrega cromozomi de ADN uman cu aceeași enzimă de restricție, deci este „capete adezive“ sunt complementare la secvențe de nucleotide la capetele plasmidei. Enzimă ligase „reticulat“, ambele capete ale ADN-ului (de gene și plasmida) rezultând într-un inel de plasmidă recombinantă, care este introdus în bacteria E. coli. Toți descendenții de bacterii numite o clonă și conțin plasmide de gene străine capabile să producă proteina codificată de această genă.

Întregul proces de obținere a acestor bacterii este numita clonare. Se compune din etape succesive (Figura 3.3.):

1. Restricție - cut ADN uman cu enzima de restricție într-o multitudine de fragmente diferite, dar cu aceleași capete „lipicioase“. Aceleași capete obținute prin tăierea ADN-ul plasmidic al aceleiași enzime de restricție.

Fig. 3.3. Introducerea genei în Escherichia coli plasmid și donarea genei în celulele de E. coli
Plasmidul clivat la un E. coli situs specific de restricție endonucleazică în ambele catene de ADN, astfel încât capetele plasmidei digerat situate secvență neasociat scurtă de deoxiribonucleotide (Aatt sau TTAA), m. E. Patru baze nucleotidice reprezentate în care adenină și timină.
Gena care urmează să fie inserată într-o plasmidă prin segregat cu aceeași enzimă de restricție, astfel încât capetele sale sunt complementare la secvențe de nucleotide pe plasmida capete (Aatt și TTAA).
Atât ADN (plasmida și gena) legate împreună folosind un ligaza. Apoi, plasmida recombinantă este introdusă într-o celulă de E. coli, care se multiplică, formează o clonă kotorog toate celulele conțin o plasmidă recombinantă, și, prin urmare, gena străină. Acestea din urmă acum clonat în celule de E. coli și induce sinteza spetsificheskogobelka ea.

2. Ligatura - includerea fragmentului ADN uman în plasmida din cauza „capete adezive“ enzimă de reticulare ligazei.

3. Transformarea - introducerea plasmidelor recombinante în celulele bacteriene, tratate într-un mod special - astfel încât acestea să devină un moment permeabil la macromolecule. Cu toate acestea, plasma MFAs penetrează numai o porțiune a bacteriilor tratate. Ele sunt separate utilizând un mediu specific (de exemplu, soluție de antibiotic). Fiecare dintre formele și multiplică o colonie de mai multe mii de descendenți bacterii transformate - o clonă.

4. Screening - selectarea clonelor de bacterii transformate includ pe acelea care păstrează o plasmidă care poartă gena umană.

Nu este întotdeauna posibil să se taie cu precizie a genei prin utilizarea enzimelor de restricție. Multe gene sunt clivate de aceste enzime în mai multe părți, sau nu conțin secvențe care sunt recunoscute de enzime de restricție. Prin urmare, în unele cazuri, procesul de clonare nu începe cu tăierea cromozomul de fragmente de ADN aleatoare, și pentru a obține gena vizate dorită.

În acest scop, din celule umane este izolată și ARN care este o copie a transcrierii a genei și de enzima - revers transcriptaza (revers transcriptaza) - sintetizat complementar catenă de ADN, urmat de m-ARN, șablonul în timpul sintezei ADN-ului este distrus RNase - enzimă specială capabilă să hidrolizeze lanțul ARN. Lanțul ADN rămas servește ca matriță pentru sinteza revers transcriptazei (ADN polimerază) complementară a doua catenă de ADN.

Rezultată dublu helix a ADN-ului se numește un ADNc (ADN complementar), aceasta corespunde genei din care a fost citit și ARN. O astfel de ADNc este încorporată într-o plasmidă, care va transforma bacteriile, iar clonele sunt preparate care conțin numai genele umane selectate.

LV Timoșenko, MV Chubik